Precauzioni: Indossare guanti di lattice e utilizzare vetreria sterile (RNAse free)

Materiale di partenza: 10⁷ -10⁹ cellule o 1 g di tessuto.

1. Al materiale di partenza si aggiungono 8 ml di soluzione di lisi contenente guanidinio tiocianato che oltre a lisare le cellule denatura 1'RNasi impedendo così la degradazione dell'RNA.
2. Il campione viene omogeneizzato per disaggregare e rompere completamente le cellule
   Composizione soluzione di lisi
   4M guanidinio tiocianato 1M Na Acetato pH 4
   0.5% lauril sarcosina
   l00 mM b-mercaptoetanolo
3. Si effettua un'estrazione fenolo/cloroformio in ambiente acido (pH 4) per eliminare le membrane, le proteine e il DNA liberato dopo la lisi. Al campione si aggiunge 1 volume di fenolo, 1/2 volume di cloroformio e 1/10 volume di tampone Na-acetato 2M a pH 4 e si agita bene per amalgamare le due fasi. Si lascia 15 min. in ghiaccio e successivamente si centrifuga a 12000 RPM per 10 min. a 4 °C.
4. La fase acquosa soprastante viene prelevata senza rimuovere la pellicola di proteine e DNA che si e formata all'interfaccia. Nella fase acquosa è presente solo 1'RNA che viene precipitato a freddo (-20 °C) aggiungendo 1 volume di isopropanolo e lasciando decantare per almeno 3 ore (piu lungo e questo tempo e maggiore e la resa finale di RNA).
5. Si centrifuga a 12000 RPM per 10 min. a 4 °C e dopo aver eliminato il sopranatante si risospende il precipitato in 400 ml di soluzione di lisi.
6. L'RNA in soluzione viene nuovamente precipitato aggiungendo 2 volumi di etanolo assoluto, lasciando decantare over-night a -20 °C e centrifugando a 12000 RPM per 10 min. a 4 °C.
7. Dopo aver eliminate il sopranatante si rimuovono i sali aggiungendo 500 ml di etanolo al 70%, centrifugando nuovamente e rimuovendo il liquido surnatante.
8. II precipitato viene asciugato all'aria per eliminare ogni traccia di etanolo e viene quindi solubilizzato in 100 ml di H20 sterile.

• La qualità viene valutare mediante un'elettroforesi su gel di agarosio/formaldeide in modo da accertarsi che 1' RNA ottenuto non sia degradato.
• La quantità di RNA ottenuto viene determinata mediante una misura spettrofotometrica effettuata a l = 260 nm.

Per protocolli più dettagliati per l'estrazione di RNA da campioni clinici, consultare questo sito