Tecnica Waddle

In una cuvetta di quarzo dallo spessore di 1 cm si leggono le assorbanze dei vari campioni a 225 nm e 215 nm.

Lettura del bianco a 215 nm: 0.500 ml acqua + 0.500 ml NaOH (1/150 N)

Bianco

A215

B1

 

A questo punto si annota la A215 oppure si esegue un azzeramento dello spettrofotometro.

 

Lettura dello standard (tre volte con tre concentrazioni diverse) per definire una retta di taratura DA versus concentrazione BSA (Bovine Serum Albumin).

Standadrd: 0.500 ml NaOH (1/150 N) + (0.500 - x) ml H2O + x ml di una soluzione a concentrazione nota di BSA

[BSA]1=

[BSA]2=

[BSA]3=

 

A225

A215

DA

BSA

 

 

 

BSA

 

 

 

BSA

 

 

 

 DA = Differenza tra A215 - A225 - Abianco

 

Lettura di quattro diverse diluizioni (tra 5 e 50 mg/ml) in soluzione di NaOH (1/150 N) della soluzione di partenza del campione:

 

Campione

A225

A215

DA

mg/ml

Diluizione effettuata

Concentrazione di partenza

Concentrazione Media

1

 

 

 

 

      

2

 

 

 

 

    

3

 

 

 

 

    

4

 

 

 

 

    

 

Dalla retta di taratura si estrapolano i valori di concentrazione delle soluzioni diluite. Da queste si calcola la concentrazione iniziale moltiplicando per il fattore di diluizione. La media di questi valori darà la concentrazione effettiva della soluzione di partenza del campione.

Tecnica dosaggio Tirosina

In una cuvetta di quarzo dallo spessore di 1 cm si legge l'assorbanza dei campioni a 280 nm.

Lettura del bianco a 280 nm: 1 ml soluzione di guanidinio cloruro 6M in tampone sodio-fosfato 20 mM a pH 6.5.

A questo punto si esegue un azzeramento dello spettrofotometro alla lunghezza d'onda fissata a 280 nm.

In questo caso non è necessaria una retta di taratura in quanto è noto il coefficiente di estinzione molare per la Tirosina a 280 nm (e280 = 1290 M-1 cm-1).

Si effettuano diverse diluizioni di soluzione di partenza del peptide.

 

Campione

A280

C = A280/( e280 x l)

Diluizione effettuata

Concentrazione di partenza

Concentrazione Media

1

 

 

      

2

 

 

    

3

 

 

    

4

 

 

    

 

Dal valore di assorbanza si calcolano i valori di concentrazione delle soluzioni diluite usando la formula A280 = e280 x [ C ] x l ( A = assorbanza, e = coefficiente di estinzione molare, l = lunghezza della cuvetta di quarzo). Da questi valori si calcola poi la concentrazione iniziale moltiplicando per il fattore di diluizione. La media di questi valori darà la concentrazione effettiva della soluzione di partenza del campione.