Sintesi di peptidi

SPPS - SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS

(Sintesi di peptidi in fase solida)

Sintesi manuale di peptidi in fase solida

Strumenti Necessari:
Camera a vuoto
Siringa con filtro e rubinetto
Pipette Pasteur
Fornetto

Reagenti e solventi
DMF - synthesis grade (oppure N-metilpirrolidone, NMP)
Ammino acidi protetti sul gruppo a-aminico con il gruppo Fmoc, e sulle catene laterali con tritile (Cys, His, Gln, Asn), tert-butile (Thr, Ser, Tyr, Asp, Glu), pentametildiidrofuransulfonil (Arg), butilossicarbonile (Lys, Trp)
Attivatori: derivati di idrossibenzotriazolo (HBTU o HATU o PyBop) anche associati con idrossibenzotriazzolo (HOBT) Base: diisopropilammina (DIPEA), trietilammina (TEA), trimetilpyridina o N-metylmorfolina

La sintesi parte dall'amminoacido C-terminale.

PREPARAZIONE:

E' possibile preparare previamente resina con l'ammino acido C-terminale ancorato, oppure acquistarla. Per Peptidi con il C-terminale ammidato, si utilizza direttamente una resina con gruppo ancorante tipo RINK.

Porre in una siringa di PTFE con rubinetto in teflon la resina pesata.

Porre la siringa sulla stazione a vuoto controllando prima che tutte le valvole siano chiuse.

Assicurarsi che nella stazione a vuoto sia presente un beaker per la raccolta dei solventi.

Lasciar rigonfiare la resina con il solvente (NMP o DMF) per 30', mescolando ogni tanto con una pipetta Pasteur precedentemente otturata sulla fiamma del bunsen.

Rimuovere il solvente aprendo le valvole con la pompa a vuoto azionata.

CLIVAGGIO DEL GRUPPO Fmoc:

Aggiungere una soluzione al 20 % di PIPERIDINA (o in alternativa, una soluzione al di DBU, non compatibile con Asp) in NMP o DMF per 10' minuti mescolando ogni tanto con la pipetta Pasteur otturata.

Aprire le valvole e la pompa per far uscire il solvente. E' opportuno raccogliere questo solvente in un beaker nuovo per poter misurare l'assorbimento del dibenzofulvene che si forma fra piperidina e gruppo Fmoc. Questo permette di quantificare i gruppi amminici terminali e monitorare l'andamento della sintesi

dove A₃₀₁ è l'assorbimento a 301nm, e₃₀₁ è il coefficiente di estinzione del fulvene (7800 M^-1 cm^-1), V è il volume in ml della soluzione di clivaggio (NB può essere necessario diluire per misurare l'assorbanza) e g è il peso totale della resina

Ripetere una seconda volta.

Lavare per tre volte con il solvente (NMP o DMF) portando ogni volta a secco la resina applicando il vuoto.

ACCOPPIAMENTO DELL'AMINOACIDO:

Sciogliere l'aminoacido e gli attivatori TBTU/HOBT oppure HOAT/HATU oppure PYBOP/HOBT a seconda del caso nel minimo volume possibile di solvente, in proporzione 1:1. L'eccesso di AA rispetto alla sostituzione della resina (mmoli di peptide sintetizzati) varia generalmente da 4 a 8

Aggiungere alla resina ed attendere 5 Min per la preattivazione sotto flusso d'azoto. (N₂ bubbling).

Aggiungere DIPEA in eccesso di 1.7 volte rispetto all'eccesso di aminoacido. Controllare comunque che la soluzione è basica con una cartina tornasole umida, posta appena sopra il solvente nel flusso d'azoto

Rimuovere la siringa opportunamente sigillata dalla stazione a vuoto e lasciare che la reazione avvenga a caldo nel fornetto (40 C). Tempo di reazione: 60-90' se si usa TBTU/HOBT, 45' se si usa HOAT/HATU, 120-240' se si usa PyBop. Mescolanre di tanto in tanto.

Riporre la siringa sulla stazione a vuoto, rimuovere il solvente e lavare per due volte con il solvente.

Controllare l'avvenuto accopiamento mediante il test di Kaiser (della Ninidrina), che evidenzia la presenza di gruppi amminici non reagiti mediante una reazione colorimetrica.

Se il test di Kaiser è negativo, procedere con l'accopiamento successivo. Se positivo, significa che non tutti i gruppi amminici terminali hanno reagito. Si puo quindi eseguire un secondo accopiamento con lo stesso amminoacido, cambiando attivatore (noto come 'double coupling').

CAPPING:

Se in seguito a double coupling il test della ninidrina è ancora parzialmente positivo, o si sospetta che non tutti i gruppi amminici terminali abbiano reagito, si possono bloccare con una reazione di capping. Questo produce peptidi troncati come impurezze della sintesi, che sono più facili da separare dal prodotto corretto che peptidi di delezione che si produrrebbero se i gruppi amminici non reagiti in questo ciclo reagissero in successivi cicli di accopiamento.

Trattare con una soluzione al 20% di anidride acetica in NMP o DMF per 5', preparando una soluzione fresca ogni giorno.
Lavare per tre volte con NMP o DMF.

A questo punto si ricomincia il tutto ripartendo dal clivaggio del gruppo Fmoc ed aggiungendo la quantità necessaria del secondo aminoacido

Alla fine di ogni giornata lavare la resina con NMP o DMF e successivamente con Diclorometano, e conservare in frigorifero.

Al mattino è necessario rigonfiare la resina con NMP o DMF per almeno 30 Min prima di ricominciare dal clivaggio dell'Fmoc.

Per svolgere la sintesi si consiglia di seguire scrupolosamente il seguente foglio di sintesi. (Formato WORD)

Foglio di sintesi

Clivaggio dalla resina Avendo completato la sintesi (aggiunta del residuo N-terminale), si stacca per un'ultima volta il gruppo Fmoc.

Procedere quindi al lavaggio della resina come indiacto sopra.

Aggiungere un opportuno cocktail di clivaggio a secondo dei gruppi protettori presenti. Questo coctail viene aggiunto direttamente nella siringa, con volume 10/20 ml per grammo di resina.

Un cocktail universale è il Reagente K: acido trifluoroacetico (TFA), acqua, fenolo, tioanisolo, etanditiolo (EDT) e triisopropilsilano (TIPS) in proporzione 82.5:5:5;5:2.5:2.5:2.5O

Dopo due ore raccogliere la soluzione di TFA applicando vuoto. Eseguire un lavaggio della resina con alcuni ml di TFA puro e raccogliere nella stessa provetta.

Aggiungere 5/10 volumi di tertbutil metiletere a -20°C per precipitare. Centrifugare e separare il precipitato

Lavare il precipitato 4 volte con dietiletere freddo per rimuovere tracce di reagenti del cocktail

Risospendere il peptide in 10mM HCl e liofilizzare.