Spettrometria di massa Electrospray (ES-MS)
Preparare il solvente composto da parti uguali di acqua (MilliQ) ed acetonitrile (BDH Far UV grade), con aggiunta di 0.5% di acido formico (98% Baker Analyzed Reagent). In alternativa, per molecole poco solubili si può utilizzare una miscela acqua/metanolo o metanolo puro (Carlo Erba, ACS-ISO for Analisys). Questi solventi sono adatti per ionizzazioni in positivo (es. –NH2+ H+ -----> -NH3+). Per ionizzazioni in negativo (es. COOH ----> COO- + H+) utilizzare 2% NH3 (Carlo Erba, RPE, 30%) in acqua/acetonitrile (50:50).
Il campione da analizzare viene sciolto nell'opportuno solvente in una fiala Eppendorf (si consiglia almeno 1 mg di peptide/proteina in 100 ml) di solvente. La fiala viene centrifugata a 13000 rpm con centrifuga da banco per sedimentare eventuale materiale particolato che potrebbe intasare il capillare. Alternativamente utilizzare direttamente l'eluato d'una corsa RP-HPLC (gradiente acqua/acetonitrile con 0.05% TFA, campione iniettato 10 mg) corrispondente alla frazione d'analizzare. Il campione viene iniettato nel capillare (vedi figure) utilizzando una siringa Hamilton da 100
m, con un flusso di 100 m l/hr, mediante pompa ad infusione.All’estremità opposta del capillare la soluzione iniettata viene nebulizzata per la contemporanea azione di un getto di aria compressa e dell’applicazione di un elevato voltaggio (5000/6000 V in positivo, oppure –5000/-6000 V nel caso di analisi in negativo).
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In questo modo, il campione viene ionizzato mediante l'esplosione coulombica delle goccioline di nebulizzato e quindi posto nelle condizioni ottimali per essere analizzato. Gli ioni sono accellerati dal campo eletrico prodotto da un voltaggio di ca. 5000 V applicato fra la punta del capillare ed una piastra sullo strumento. Gli ioni accellerati entrano nello strumento attraverso un orifizio in questa piastra e transitano per una camera d’interfaccia nella quale fluisce un gas tampone (N2 chromatograophic grade).
All’altro lato di questa camera si trova il micro orifizio che dà accesso alla parte dello strumento sotto vuoto spinto. Tra i due orifizi viene applicato un voltaggio di 40-150 mV (parametro OR regolabile dal programma di controllo ed acquisizione dati). Maggiore è il voltaggio, maggiore è l'accellerazione subita dagli ioni di campione, quindi maggiore è la forza cinetica delle collisioni fra questi e le molecole di gas tampone e migliore lo stripping di contro-ioni e molecole di solvente da ioni di campione transitanti (NB una collisione eccessivamente energetica può causare frammentazione).
Il valore ottimale per l’analisi dei peptidi è di circa 90 V in quanto garantisce la rimozione di specie non legate covalentemente allo ione primario (acqua, sali …), ma, normalmente, non è sufficiente a provocare la frammentazione del peptide stesso.
Nella camera ad alto vuoto gli ioni vengono separati in base al loro rapporto massa/carica.
Questo viene effettuato da parte di uno o più quadrupoli in uno strumento ESI-Q. A voltaggi OR bassi (40-60 mV) si osservano preferenzialmente ioni ad alta carica, quindi bassi valori di massa/carica. (ioni molto carichi risentono maggiormente della scarsa accelerazione fornita dall’OR, ma sono meno puliti perché lo stripping di solvente, sali, ecc. è meno efficiente). A voltaggi più alti (>90 mV) aumenta il segnale dovuto a ioni con bassa carica e quindi alti valori di massa /carica. (Il voltaggio OR è sufficientemente alto per attrarli all'orifizio interno). Il segnale è anche più pulito (stripping più efficiente), ma gli ioni più carichi potrebbero risentire di frammentazioni.
In uno spettro di massa, l'asse delle x riporta valori di rapporto massa/carica e l'asse delle y valori di abbondanza relativa degli ioni analizzati.
Il peptide ionizza in maniera multipla dando segnali con valori M+1, (M+2)/2, etc. In alcuni casi è stato osservato anche un segnale (2M+1)/3, dovuto a dimerizzazioni mediante interazioni idrofobiche di tipo non covalente (qui sopra il picco a circa 1400).
Caratteristiche tecniche
Spettrometro di massa API I Perkin Elmer
Ubicazione: Pianoterra Edificio C11 Dip. B.B.C.M. Via L. Giorgieri 1 - 34127 Trieste
- Range di massa fino da 10 a 2400 a.m.u.
- Sorgente per ionizzazione chimica a pressione ambiente (API) con elettrodo a corona
- Ionizzazione positiva e negativa
- Rivelatore CEM per ioni positivi e negativi
- Interfaccia Ion Spray
- Cromatografo HPLC Perkin Elmer con sistema a doppia rilevazione spettroscopico