MATERIALI UTILIZZATI PER ANALISI O PURIFICAZIONE DI DNA

Sangue, saliva, sperma, capelli, ceulule, nuclei.

(DNA puo essere amplificato mediante Polymerase Chain Reaction/PCR o prodotto mediante trascrizione inversa da mRNA)

 

PREPARAZIONE DI DNA(RNA) DA CELLULE EUCARIOTE

  1. Cellule (109) lisate etrattate con proteinasi K per liberare gli acidi nucleici
  2. Estrazione con fenolo (pH 7.8) - cloroformio 1:1, separando le fasi mediante centrifugazione (10 min, 12000 RPM)
  3. Aggiungere alla fase acquosa 1/10 volume di acetato di sodio 1M e poi 2.5 volumi di etanolo
  4. DNA genomico precipita immediatamente (insieme a RNA), puo essere raccolto con un uncino di vetro oppure per sedimentazione e ricentrifugato in 80% etanolo a -20° C
  5. Trattare con RNAsi, per degradare l'RNA riestrarre con fenolo-cloroformio e precipitare con etanolo
  6. Esaminare assorbimento a 320. 280 e 260 nm; la presenza di assorbimento a 320 nm indica contaminazione di DNA da parte di solventi organici. mentre 1'entita di contaminazione da proteine e determinabile in base al rapporto A260 nm/A280 nm. che deve essere superiore a 1.8-1.9
  7. Sperimentalmente si è notato che 50 mg/ml di DNA a doppia elica hanno un assorbimento di ~ 1.0 (in cuvette di 1 cm di lato)


Per protocolli più dettagliati per l'estrazione di DNA da campioni clinici, consultare questo sito