La spettroscopia di dicroismo circolare è usata per ottenere informazioni riguardanti la struttura secondaria di proteine e polipeptidi in soluzione.
Vantaggi : Bassa concentrazione dei campioni (200ml of 0.5
mg/ml soluzione), tecnica non-distruttiva. Cambiamenti dovuti ad ambienti esterni diversi (pH, denaturanti, temperatura,....) possono essere rilevati con accuratezza.
Svantaggi : interferenza con l'ambiente esterno se costituito da solventi che assorbono nella regione dell'UV, misure possibili solo con campioni molto diluiti.
Il dicroismo circolare (CD) viene osservato quando molecole otticamente attive assorbono diversamente la luce circolarmente polarizzata destra e sinistra. Viene misurato con un spettropolarimetro CD, che è relativamente costoso. Lo strumento deve essere in grado di misurare accuratamente a lunghezze d'onda fino a 190-170 nm. Gli spettri CD di diversi tipi di strutture secondarie presenti sono differenti. Quindi l'analisi dei loro spettri CD può dare informazioni utili su porzioni di strutture secondarie presenti nelle macromolecole biologiche.
La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità (Figura 1 a sinistra). La combinazione delle due componenti circolarmente polraizzate in direzione opposta, quindi risulta in luce lineramente polarizzata che oscilla in un piano perpendicolare alla direzione di propagazione. Quando questa luce incontra un campione otticamente attivo, con un diverso assorbimento per una delle due componenti di luce circolarmente polarizzata (a destra o a sinistra), l'intensità di una delle viene ridotta maggiormente rispetto all'altra. Il risultato sarà che quando ricombinati, questi due componenti danno luogo a luce che non è più linearmente polarizzata (Figura 1 a sinistra, pannella a), ma a luce ellitticamente polarizzata (figura 1, destra, pannello b) . Questo effetto viene chiamato Dicroismo Circolare.
Figure 1 Sinistra - componenti di luce polarizzata a destra e sinistra si sommano per produrre luce polarizzata linearmente (in alto, visualizzata nel piano della pagina, in basso perpendicolare al piano). Destra; (a) Altra visualizzazione della luce linearmente polarizzata composta da componenti circolarmente di ugualie in intensità e fase. (b): un differente assorbimento delle due componenti destra e sinistra da parte di una sostanza chirale, riduce l'intensità di una componente circolarmente polarizzata rispetto all'altra, che quando ricombinate danno ora luogo a luce elitticamente polarizzata.
I più comuni sono quelli prodotti dalla JASCO, Jobin Yvon, OLIS, and AVIV . Il dipartimento di Scienze chimiche dispone di un modello Jasco J600.
Preparazione dei campioni e misurazioni Additivi, tamponi e agenti stabilizzanti: Qualunque composto che assorba nella regione 250 - 190 nm deve essere evitato. Qualunque tampone o detergente o altro composto chimico non dovrebbe essere usato se maschera il segnale.
Soluzione: Deve quindi contenere solo quei composti necessari alla stabilità delle molecole da analizzare e alla concentrazione più bassa possibile. Il composto da analizzare deve quindi essere il più puro possibile. Misurazioni: Gli esperimenti iniziali servono per trovare le condizioni ottimali per l'esperimento reale. Cellette di quarzo of 0.5 mm sono un buon punto di partenza. Si eseguono sempre generalmente spettri dell'aria e della soluzione senza il campione per controllo. La concentrazione del campione deve essere nota e attorno ai 0.5 mg/ml La differenza in assorbimento delle componenti di luce circolarmente polarizzata a
destra ed a sinistra è generalmente è molto piccola ma può essere accuratamente misurata.
Si è trovato empiricamente che : > q = 2.303 DE x 180 / 4
= 33 DE gradi
Inizialmente si eseguono spettri dell'aria e della soluzione senza il campione (bianco) per ottenere il segnale
di fondo.
Il campione viene poi analizzato e lo spettro viene registrato come media di tre o più accumuli.
Il parametro che viene misurato dallo strumento è q che indica l'ellitticità:
